O acervo museológico do MFRB conta em média três mil peças tridimensionais, as quais estão em processo de catalogação contínuo. O acervo divide-se em: musealizado (indumentária, obras de arte, louças, acervo etnográfico) e funcional (ferramentas, sinalização ferroviária, capacetes) ainda utilizados nas composições ferroviárias que também integram o acervo, no setor de grandes peças.
O acervo documental é formado por mais de 500 mil documentos, entre eles fotografias, periódicos, relatórios, mapas, plantas, processos entre outros. Cerca de 10 mil documentos já foram digitalizados e estão disponíveis para consulta no portal : https://www.projetomuseuferroviario.com.br/"
Como resultado da coleta de depoimentos de ferroviários, familiares e pessoas ligadas a história da ferrovia, o Museu Ferroviário salvaguarda mais de 500 horas de áudio e vídeo depoimentos, bem como documentários e outras produções de audiovisual ligadas à ferrovia.